Diagnosticul virusologie implica reactivi costisitori, tehnologii sofisticate si mana de lucru calificata. Fund un diagnostic scump, el trebuie solicitat in circumstante bine justificate, lata cate situatii in care necesitatea unui diagnostic virusologie precis se impune:
- boli in care diagnosticul argumenteaza masuri terapeutice speciale (ex. rubeola in primul trimestru al sarcinii impune avortul terapeutic);
- elucidarea etiologiei virale a unor izbucniri epidemice (meningite, pneumonii, gastroenterite, exanteme);
- supravegherea cpidemiologica si urmarirea actiunilor profilactice.

RECOLTAREA SPECIMENELOR

Recoltarea produselor destinate diagnosticului (spalatura nazofaringiana, sange, LCR, fecale, exudat sau cruste din leziuni cutanate, etc.) trebuie facuta la locul si la timpul potrivit.
Aceasta inseamna cunoasterea unui minim de date privind debutul simptomelor clinice (vechimea lor), circumstantele infectiei, tratamentele incercate, etc. Izolarea virusului are sanse de reusita la inceputul bolii, anticorpii de tip IgM se pot evidentia la sfarsitul primei saptamani iar seroconversia este demonstrata numai prin area titrului anticorpilor pe probe duble de ser (una recoltata la debut, cea de-a doua in conlescenta - elul 11.1.). Probele destinate izolarii virusului sunt transportate la laborator in cel mai scurt timp, iar, aici, alegerea sistemului de cultire depinde de suspiciunea clinicianului privind etiologia bolii (elul 11.2). Utilizarea unui mediu de transport se impune ori de cate ori este previzibila intarzierea transportului sau stocajul in laborator. Componentele mediului de transport sunt: solutie salina fiziologica, o substanta proteica (albumina, gelatina), antibiotice, antifungice, carbune actit, etc.
Nu trebuie omise niciodata regulile de autoprotectie si de protectie a anturajului la recoltarea, transportul si prelucrarea probelor patologice. Acestea sunt infectante si pot contamina operatorul si tot instrumentarul folosit. Masurile de dezinfectie si de lucru in incinte izolate trebuiesc respectate cu strictete.

TEHNICI DE DIAGNOSTIC
Exista patru directii principale de diagnostic virusologie:
- izolarea virala;
- identificarea genomica (diagnostic molecular prin hibridarea acizilor nucleici):
- tehnici microscopice;

- tehnici serologice.

IZOLAREA VIRALA

Investigarea oricarei boli virale incepe cu gasirea unui sistem de izolare a agentului etiologic. Optiunea pentru gazda naturala este cea mai logica, insa, in cazul clinicii umane, considerente etice exclud aceasta alternati. De aceea se folosesc frecvent culturile de celule de origine umana. Orice laborator mentine atat linii celulare (cu crestere indefinita in vitro) cat si tulpini diploide umane (mentinute 30-40 subcultiri, in vitro). Numai in rare cazuri se mai folosesc pentru izolari animalul de laborator sau oul de gaina embrionat.
In culturi celulare replicarea virala este recunoscuta datorita efectului citopatic (ECP). Tipurile de leziuni produse de diferitele virusuri sunt sintetizate in elul 11.3 si in . 11.1. Pentru virusurile hemaglutinante replicarea lor mai este eluata prin hemadsorbtie (rozetarea unei suspensii de hematii in jurul celulelor infectate). Pentru virusurile noncitopatogene replicarea lor este demonstrata prin interferenta (exemplu, virusul rubeolos). in acest ultim caz se lucreaza in paralel trei flacoane: martor neinoculat, martor sigur pozitiv si flacon inoculat cu proba continand virusul noncitopato-gen. In primul timp, se inoculeaza numai ultimul flacon. In al doilea timp (dupa 34 zile), se inoculeaza ultimele doua flacoane cu virusul sigur citopatogen. Citirea se face dupa alte 3-4 zile observindu-se absenta ECP in tubul 1 si 3 si prezenta lui in tubul 2. in tubul 3 virusul inoculat initial a interferat replicarea celui de-al 2-lea virus care, in schimb, isi etaleaza citopatogenitatea in tubul 2.
Trebuiesc retinute cate exemple de inciuzii patognomonice: in rabie (turbare) -corpii Babes-Negri, in febra galbena - inciuzii Nicolau-Councillman, in riola -incluziile Guarnieri.

IDENTIFICARE GENOMICA

Pentru diagnosticul molecular prin hibridarea acizilor nucleici nu este necesara gasirea unui substrat apt de a sustine replicarea virusului in afara organismului parazitat. Sensibilitatea diferitelor tehnici de hibridare este atat de mare incat identificarea gcnomului viral poate fi realizata prin folosirea unor sonde moleculare apropriate. Aceste sonde moleculare sunt fragmente complementare unor secvente din genomul viral care recunosc si se cupleaza in mod eficient de regiunea vizata datorita legaturilor de hidrogen implicate in cuplarea bazelor azotate din dublul helix.
Din rietatea de tehnici care se bazeaza pe hibridizarea acizilor nucleici pentru determinarea unei secvente genomice virale bine definite mentionam:
- Southern blot analysis;

- Spot hybridization;

- PCR (polymerase chain reaction).
Tehnica Southern blot (de la numele descoperitorului Ed Southern-Cambridge) a fragmentele ADN rezultate dintr-o secventa lunga, clita cu enzime de restrictie. Enzimcle de restrictie sunt endonucleaze care scindeaza dublul helix in urma atasarii la silusuri anumite din lant constituite in general din secvente scurte de 6-8 baze azotate, intr-o anumita ordine. Situsul de clire fiind totdeauna acelasi, rezulta fragmente cu anumite lungimi, caracteristice fiecarui genom viral. Identificarea se face dupa separarea prin electroforeza in gel SDS- poliacrilamida prin area profilului electroforetic al probei si martorilor. Eventual, dupa separarea electroforetica, se poate proceda la transferul si imobilizarea fragmentelor pe hirtie de nitroceluloza. Identificarea, in acest caz, se face utilizind o sonda moleculara solubila marcata, complementara. Hibridarea ADN-ADN se cheama Southern blot, hibridarea ARN-ARN - Northern blot, in timp ce, recunoasterea imunologica a unei probe proteice, de asemenea imobilizata pe nitroceluloza, se numeste Western blot.
Tehnica Spot hybridization poate determina si prezenta unei secvente genomice virale specifice in situ, in probe recoltate direct din organismul infectat. Se foloseste tot o sonda moleculara solubila complementara, insa, intr-o rianta tehnica care sporeste sensibilitatea reactiei: sandwich hybridization. Tehnica hibridarii sandwich utilizeaza doua fragmente separate de acid nucleic. Ambele fragmente contin secvente complementare acidului nucleic care urmeaza a fi identificat si, in plus, contin putine secvente comune. Unul dintre fragmente este imobilizat pe nitroceluloza, celalalt este sonda moleculara solubila marcata (.11.2).
Antajul tehnicii sandwich este ca alte substante prezente in proba: proteine, mucopolizaharide, lipide nu interfera cu legarea specifica intre secventele de ADN complementare.
- PCR sau tehnica de amplificare genica este o metoda extrem de sensibila care poate decela pg ADN specific in proba. in reactii in lant, catalizate de polimeraza ADN, se amplifica exponential o secventa "tinta" din acidul nucleic care urmeaza a fi delectai. Tehnica se desfasoara in trei etape (. 11.3.):
- denaturarea dublu helixului care urmeaza a servi drept matrita;
- cuplarea amorsei {primer annealing);

- extensia lantului catalizata de polimeraza.

Fiecare etapa se desfasoara la o alta temperatura, respectiv. 90 - 95A C (denaturarea), 40 - 60A C (cuplarea), 70 - 75A C (extensia), intr-un dispozitiv numit DNA Thermal Cycler (Perkin Elmer Co.) care permite repetarea ciclica a celor trei etape. in fiecare ciclu se amplifica secvenja vizata care (dupa 20-30 cicluri) poate fi decelata prin una din metodele de hibridizare a acizilor nucleici.
Tehnica de amplificare genica a revolutionat detectia patogenilor bacterieni, virali, fun-gici si promite a aduce noi argumente in etiologia virala a riate conditii clinice cronice.

Antajele reactiilor de identificare genomica constau in:

- sensibilitate superioara in raport cu reactia antigen anticorp ca urmare a silitatii legaturilor de H dintre perechile de baze, legaturi neinfluentate de alte componente chimice ale sistemului;
- specificitate extrema putand discrimina o singura baza diferita dintr-o secventa de 20 baze;
- silitatea probei care se preteaza la diagnostic chiar dupa tratamente brutale ca extractia ADN, tratament proteolitic sau denaturari termice;
- standardizarea reactivilor utili/ap - sondele moleculare pot fi preparate prin bioinginerie.
Tehnicile de colorare histologica sau histochimica se folosesc din ce in ce mai rar in diagnosticul virusologie data fiind lipsa de specificitate a leziunilor din viroze. in plus, vizualizarea corpusculilor infectanti cu microscopul optic nu este posibila decat pentru virionii din familia Poxviridae (grupul riola-ccina) sau pentru chlamidii si rickettsii. Microscopul electronic continua inca sa aduca informatii pretioase datorita ameliorarilor tehnologice. Spre exemplu, tehnica coloratiei negative a preparatelor virale (mai ales dupa agregarea virionilor tratati cu seruri specifice) este utila in diagnosticul de laborator al multor viroze. Imunoelectronomicroscopia este o metoda sensibila si specifica de vizualizare a particulelor infectante. Se folosesc anticorpi marcati cu substante electronoopace (ferilina. Aur coloidal) care recunosc specific celulele infectate. in imunoelectronomicroscopie ca si in imunofluorescenta se folosesc doua riante tehnice majore: tehnica directa (cu anticorpi antivirali marcati) si tehnica indirecta (cu anticorpi antispecie marcati).
Imunofluorescenta este metoda microscopica de diagnostic virusologie rapid cu cea mai larga folosire. Simplitatea metodei si reactivii usor de procurat au conferit metodei o accesibilitate larga. Metoda este foarte indicata in diagnosticul virozelor monospecifice (riola, rabie, rujeola, oreion, etc.) putand determina fie prezenta antigenului specific, fie a anticorpilor. Tehnica directa presupune folosirea anticorpilor antivirali cuplati cu fluorocrom (fluoresceina sau rhodamina). Aceste substante se cupleaza in domeniul Fc al moleculei de imunoglobulina lasand nealterat situsul de recunoastere a antigenului. Fluorocromii au proprietatea de a emite o anumita lungime de unda cand sunt excitati cu un spot luminos din domeniul ultraviolet al spectrului. Dotarea laboratorului cu un microscop cu o sursa de lumina in u-v este singura cerinta deosebita pentru aplicarea imunofluorescentei.
Tehnica indirecta se realizeaza in doua etape succesive:
- cuplarea antigenului cu anticorpi antivirali nemarcati preparati pe o anumita specie de animal (ex.iepure, capra, soarece).
- recunoasterea anticorpilor de iepure care raman legati de antigenul corespunzator (in ciuda unor spalari prelungite) cu un al doilea strat de anticorpi-antispecie, de aceasta data marcati cu fluorocrom. Tehnica indirecta are un grad mai mare de specificitate. Efectuarea martorilor de "stingere" a fluorescentei permite evitarea reactiilor fals pozitive.

SEROLOGIA
Diagnosticul serologic cuprinde astazi o diversitate de tehnici care permit silirea grupului sau tipului de virus (elul nr.4) cu grad diferit de sensibilitate (elul 11.5.).

Progresele tehnologice recente in serologie constand in miniaturizarea si automatizarea tehnicilor ca si orientarea catre tehnici rapide (IF, EIA, RIA) au modificat ponderea utUizarii tehnicilor clasice (HI, FC, SN). Fiecare tehnica serologica poate decela fie antigenul, fie anticorpii antivirali, iar riantele utilizate sunt extrem de diverse.

Pentru exemplificare vom prezenta 4 riante ale tehnicii EIA in care anticorpii sunt cuplati cu un marker enzimatic (cel mai frecvent peroxidaza sau fosfataza alcalina) care urmeaza a fi evidentiat prin o reactie de culoare la adaugarea substratului. Reactia poate fi citita cu ochiul liber sau cu spectrofotometrul existand in fiecare trusa de reactivi, martori pozitivi, negativi si de prag. in instructiunile fiecarei truse sunt precizate criterii de lidare a probei (respectiv, raportul lorilor absorbantei citite la speefrofotometru pentru probele pozitive si negative) si criterii de pozitivitate (de regula, pornind de la lorile probelor prag sau pozitive la limita, (in engleza "cul-qff").

Pentru depistarea anticorpilor in EIA sunt folosite doua alternative: tehnica competiti si cea indirecta. in ambele antigenul este peliculizat pe fundul godeurilor din placile de plastic ale trusei. in tehnica competiti se adauga simultan proba (continand anticorpi sau nu) si anticorpii antivirali cuplati cu enzima. Daca proba contine anticorpi acestia vor bloca atasarea de antigenul din godeu a anticorpilor marcati cu enzima. Valorile absorbantei pentru probele pozitive sunt mai mici decat la martorul negativ.In tehnica indirecta se adauga succesiv proba si, in al doilea timp, anticorpi anti-IgG umani cuplati cu enzima. Daca anticorpii umani din proba recunosc antigenul ei raman fixati in godeu (in ciuda spalarilor) si vor fi recunoscuti de anticorpii anti-IgG uman cuplati cu enzima. Valorile absorbantei pentru probele pozitive sunt mai mari decat la martorul negativ.
Depistarea anticorpilor de tip IgM se face printr-o tehnica de "captura". in primul timp, in godeul care contine anticorpi anti IgM umani sunt captati din proba toate imunoglobulinele M. Urmeaza determinarea specificitatii antivirale a acestor anticorpi prin adaugarea antigenului viral cuplat cu enzima. Reactia specifica este decelata tot prin reactia de culoare dupa adaugarea substratului enzimei (. 11.3).
Depistarea antigenului din proba se face pe placi peliculizate cu anticorpi monoclonali care recunosc si fixeaza numai o parte din determinantii antigenici. Determinantii ramasi liberi vor fi recunoscuti de un al 2-lea anticorp monoclonal conjugat cu enzima.
Tehnica EIA ca si alte reactii serologice (RIA) sau reactiile de identificare genomica beneficiaza de un spor de sensibilitate prin folosirea sistemelor de amplificare. Un exemplu de sistem de amplificare este cuplarea cu biotina a unuia din rcactanti si evidentierea lui prin conjugatul avidina-enzima. Sistemul avidina-biotina este remarcabil prin afinitatea de cuplare care merge la dilutii de IO'15, permitand detectarea de picograme de rectanti.
Optiunea pentru un anumit test de diagnostic se face urmarind doi parametrii majori: sensibilitatea (S) si specificitatea (sp). Aceste notiuni precum si alte criterii derite se definesc din formulele prezentate mai jos.-in elul 11.6 apar termenii pozitiv/negativ aderat, respectiv pacientii al caror statut clinic corespunde rezultatelor obtinute in laborator si pozitiv/negativ fals, unde exista discordanta intre datele clinice si cele de laborator.
Sclectia testelor utilizate se face urmarind S maxima pentru testele de triaj si sp maxima pentru testele de confirmare. O eluare atenta cost-beneficiu este necesara ori de cate ori optiunea este posibila intre teste de diagnostic produse de diferiti fabricanti.
Testele cu S ridicata dau putine rezultate fals negative. Pentru a asigura o maxima securitate a donarii de sange sau organ se aleg teste cu S inalta. Investigatiile cu sp inalta dau putine rezultate fals pozitive: pentru ele se opteaza cand se urmareste confirmarea diagnosticului in cazuri particulare. Probabilitatea ca un test sa determine cu acurate|e statusul real al infectei este influentata de prelenta infectiei in populatia respecti. Logic, intr-o populatie cu prelenta mare, probabilitatea ca o serologie poziti sa reflecte o infectie reala este mare (VPP mare). Invers, o persoana serologie negati are sanse mai mari sa fie neinfectala in cazul unei prelente mici. Altfel spus, VPN scade pe masura ce prelenta creste si invers.

Concluzii

Optiunea pentru una din cele patru directii de diagnostic se face in functie de momentul recoltarii probei in cursul evolutiei bolii. Izolarea virala, identificarea genomica si microscopia electronica au sanse de reusita in etapa initiala (incubatie si faza acuta). Investigatiile serologice ne edifica asupra tipului de virus implicat dupa doua-trei saptamani de la debut. Diagnosticul rapid in viroze utilizeaza cate tehnici: imunofluorescenta, imunoelectronomicroscopia, tehnicile imunoenzimatice si diferitele riante de identificare genomica.