TREPONEMA PALLIDUM

Genul Treponema apartine familiei Spirochaetaceae si cuprinde:

a. Treponeme patogene pentru om

Treponema pallidum, cu trei subspecii diferentiate numai prin caracterele clinico-epidemiologice ale bolilor determinate: subspecia pallidum (agentul etiologic al sifilisului venerian), subspecia endemicum (agentul etiologic al bejelului, care determina sifilisul endemic non-venerian ce afecteaza copin si adultii din regiunile desertice africane), subspecia pertenue (agentul etiologic al pianului, responsabil de leziuni cutaneo-mucoase la copii in zonele tropicale umede).

Treponema carateum, agentul etiologic al bolii numita pinta, boala cutanata ce afecteaza populatia tanara (copii si adolescenti) din regiunile tropicale ale Americii Centrale si de Sud.

b.Treponeme saprofite

Treponema genitalis si Treponema caligryrum, intalnite pe mucoasa genitala.

Treponema microdentium si Treponema mucosum, intalnite pe mucoasa bucala sau in unele infectii locale.

c. Treponeme de interes medical

Treponema Reiter: tulpina de laborator, izolata de la om, cultivata pe medii artificiale, in conditii de anaerobioza. Este nepatogena si se inrudeste antigenic cu Treponema pallidum, de aceea este folosita pentru prepararea unor antigene de diagnostic serologic al sifilisului.

Treponema pallidum-tulpina Nichols, tulpina patogena de laborator a Treponemei pallidum. Se obtine prin inocularea prelevatelor de la bolnavii de sifilis, intratesticular la iepuri, unde genereaza orhita experimentala. Sifilisul experimental la iepuri reprezinta singura posibilitate de pastrare in laborator a tulpinilor de treponeme patogene folosite in testele serologice de diagnostic al sifilisului.

Treponema cuniculi: patogena in mod natural pentru iepure, la care produce o infectie genitala, care o deosebeste de tulpina Nichols.

Treponema pallidum este agentul etiologic al sifilisului, boala dermato-venerica. Transmiterea se face totdeauna prin contact sexual direct (vitalitatea treponemelor in afara organismului uman este slaba).

Dupa o perioada de incubatie silentioasa de aproximativ 3 saptamani (cu limite intre 2 si 10 saptamani), treponemele se multiplica la nivelul portii de intrare (genitala, anala, ocazional bucala), unele diseminand si la nivelul ganglionilor limfatici de unde trec apoi in marea circulatie.

Faza primara a infectiei se caracterizeaza prin aparitia sancrului sifilitic, o papula care se ulcereaza rapid, dand o leziune superficiala, nedureroasa, cu baza indurata si acompaniata de adenopatie satelita. Sancrul si ganglionii sateliti sunt bogati in treponeme. Netratata, leziunea se vindeca spontan in 3-6 saptamani, iar adenopatia se remite putin mai tarziu.

Faza secundara corespunde etapei de diseminare a treponemelor. Ea debuteaza aproximativ in doua luni de la contactul infectant si se caracterizeaza printr-un tablou lezional cu localizare cutaneo-mucoasa variata (rozeole, sifilidele, placi mucoase, condiloame, alopecie, atingeri unghiale etc.) si care poate fi acompaniat de micro-poliadenopatii si de un sindrom infectios. Toate leziunile secundare sunt bogate in treponeme de unde rezulta si marea lor contagiozitate. Aceste manifestari se remit spontan, dar recaderile se pot produce in urmatorii 3-5 ani.

Urmeaza faza de latenta, etapa in care sifilisul este clinic asimptomatic si necontagios.

Dupa o perioada de timp variabila, de 2 pana la 10 ani, boala intra in faza tertiara caracterizata prin atingeri viscerale, cardio-vasculare (aortitita luetica, anevrism de aorta, insuficienta aortica) sau neurologice (tabes, paralizie generala), asociate cu leziuni osoase sau cutaneo-mucoase granulomatoase (goma sifilitica). In toate leziunile tertiare treponemele sunt rare.

Etapele primara, secundara si de latenta reprezinta fazele precoce sau bacteriologice ale maladiei.

Sifilisul congenital. Boala se poate transmite la fat de la o mama cu sifilis evolutiv. Pasajul transplacentar al Treponemei pallidum va determina o atingere sistemica a produsului de conceptie ducand fie la moarte fetala, fie, in cazul in care copilul traieste, la manifestari clinice caracteristice sifilisului congenital (leziuni cutanate buloase, ragade, sau leziuni sistemice, precum keratita, malformatii dentare si nazale, periostita, anomalii ale SNC, retard intelectual).

Treponema pallidum este un germen fragil care nu supravietuieste in mediul exterior fiind adaptat strict patologiei umane.

Injectia intratesticulara a Treponemei pallidum la iepure provoaca in cateva zile o orhita, tesutul inflamat fiind bogat in treponeme. Tulpina Nichols este intretinuta in acest mod in vederea testului de diagnostic Nelson.

Diagnosticul de laborator consta in diagnostic bacteriologic minor (urmareste punerea in evidenta a Treponemei pallidum prin examen direct, posibil numai in sifilisul primar) si diagnostic serologic major.

1. RECOLTAREA PRODUSELOR PATOLOGICE

Sifilisul va fi luat in discutie in fata unei eroziuni sau ulceratii cu localizare ano-genitala si bucala, la un subiect in perioada de activitate sexuala. Diagnosticul bacteriologic al prelevatelor se va efectua inaintea tratamentului cu antibiotice, treponemele disparand in cateva ore dupa administrarea de penicilina.

Prelevatele vor consta din serozitati nesangerande de la nivelul sancrului sifilitic, placilor mucoase, mai rar produs de punctie gaglionara.

2. DIAGNOSTIC MICROBIOLOGIC

2.1. Examenul direct

Se realizeaza pe preparat proaspat si preparat colorat.

Preparatul proaspat se examineaza intre lama si lamela, pe fond intunecat. Treponemele apar sub forma de filamente foarte subtiri cu 7-l3 spire stranse, regulate, cu capetele efilate, mobile. Miscarea lor este de rotatie axiala, pendulare, translatie si flexiune (ura 1).

Preparatul colorat. Se folosesc coloratii precum Gram prelungit, Vago, impregnatia argentica (urile 2 si 3).

Daca in coloratia Gram treponemele se coloreaza in roz palid (de aici denumirea de Treponema pallidum - este vorba despre o coloratie a peretelui de tip Gram - negativa), in impregnatia argentica (metoda Fontana-Tribondeau), treponemele apar de culoare neagra.

Coloratia Vago este utilizata pentru evidentierea Treponemelor, Leptospirelor si Borreliilor. Reactivii pentru colorat au avantajul de a fi mai ieftini si mai stabili decat cei pentru impregnatia argentica.

Tehnica

Se etaleaza un frotiu pe o lama port-obiect de sticla. Nu se fixeaza la cald.

Se acopera preparatul cu o solutie filtrata de mercurocrom 2% timp de 3-5 minute.

Se spala cu apa distilata.

Se coloreaza timp de 5 minute cu o solutie filtrata de Verde de metil 2%.

Se spala cu apa distilata si se lasa sa se usuce.

Se examineaza cu obiectivul cu imersie.

Bacteriile apar colorate in violet clar pe un fond aproape incolor.

Prepararea reactivilor

- Solutia de mercurocrom 2%. 1 g mercurocrom pulbere fina dizolvat in 50 ml apa distilata calduta. Se agita si se lasa in repaus cateva minute dupa care se filtreaza. Se conserva in flacoane de sticla inchisa la culoare, filtrand din cand in cand.

- Solutia de verde de metil 2% . Intr-un mojar se faramiteaza foarte fin 1 g verde de metil, peste care se adauga 50 ml apa distilata fierbinte. Se agita bine, dupa care se lasa in repaus; se filtreaza si se pastreaza in flacon de sticla de culoare inchisa, filtrand din cand in cand. Acesti reactivi se conserva timp de o luna.

Metodele de coloratie au dezavantajul de a deforma treponemele, de unde si preferintele microbiologilor pentru examenul in imunofluorescenta.

ura 1: Aspectul treponemelor la examenul direct, la microscopul cu fond intunecat.

(sursa: https://www.atlas.dermato.org./images)

ura 2: Tr. pallidum - Coloratie Gram

(sursa: https://www.pelin.mf.uni_lj.si/pedag/microbi.html)

2.2. Identificarea

Se bazeaza pe caracterele de patogenitate prin inocularea treponemelor la iepure intratesticular, care in 7-l4 zile face o orhita.

Identificarea se poate face si prin examen in imunofluorescenta atat prin tehnica directa cat si indirecta.

- Tehnica imunofluorescentei directe. Frotiul este acoperit cu anticorpi anti-Treponema pallidum marcati cu o substanta fluorescenta (izotiocianat de fluoresceina) si diluati intr-un contracolorant (albastru de Evans). Dupa spalare frotiul se examineaza in lumina ultravioleta.

- Tehnica imunofluorescentei indirecte. Frotiul este acoperit cu anticorpi anti-Treponema pallidum nemarcati (umani sau animali) care se fixeaza pe treponeme; ca revelator se folosesc antiglobuline fluorescente de specie (antiglobulina umana sau animala), diluate intr-un contra-colorant (ura 4).

Prezenta treponemelor nu semnifica totdeauna o infectie treponemica, existand la nivelul mucoaselor si treponeme saprofite, dupa cum nici un examen negativ nu exclude o infectie reala.

ura 3: Treponeme - frotiu din serozitate

(sursa: https://www.pelin.mf.uni_lj.si/pedag/microbi.html)

ura 4: Treponeme - aspect in imunofluorescenta

(https://www.primer.ru/std/ gallery_std/treponema.htm)

3. DIAGNOSTICUL SEROLOGIC

Treponemele patogene nefiind cultivabile, dianosticul de certitudine al sifilisului este realizat in urma examenelor serologice.

Prezenta anticorpilor aparuti in urma contactului organismului cu Treponema pallidum se evidentiaza prin doua mari grupe de teste:

teste cu antigene cardiolipinice;

teste cu antigene treponemice.

Dintre numeroasele tehnici si variante tehnice preconizate, cele mai utilizate sunt urmatoarele:

Pentru bilantul initial de depistare

RPR: Rapid Plasma Reading test;

VDRL: Veneral Disease Reaserch Laboratory;

TPHA: Treponema Pallidum Haemagglutination Assay ( mai specifica).

Ca bilant complementar

TIT: testul de imobilizare a treponemelor (Testul Nelson, specific).

FTA-ABS

: Fluorescent Treponema Assay.

3.1. Teste cu antigene cardiolipinice

Permit identificarea anticorpilor de tip reaginic. Reactiile nu sunt specifice, antigenul cardiolipinic fiind prezent si in celulele animale si vegetale, nu numai in membrana citoplasmatica a treponemelor.

A fost utilizat in prima metoda de determinare a sifilisului de catre Wasermann, care a folosit reactia de fixare a complementului a lui Bordet, de unde si denumirea comuna data tehnicii: reactia Bordet-Wasermann, prescurtat RBW.

Reactia are astazi valoare istorica: desi inca indicata de unii medici, reactia de fixarea a complementului Bordet-Wasermann in diagnosticul serologic al sifilisului nu mai ureaza in Nomenclatorul International al actelor biologice din octombrie 1980 !

3.1.1. Reactia de floculare - testul V.D.R.L. (Veneral Disease Research Laboratory)

Reactie clasica, singura ce se mai practica inca. Este o reactie de precipitare in mediul lichid cu un antigen cardiolipinic de origine animala si comun cu Tr. pallidum.

Reactia calitativa

In godeul unei placi se pun in contact 0,05 ml ser de bolnav inactivat si o picatura de antigen cardiolopidic diluat 1/60 ml. Dupa agitare timp de 4 minute cu ajutorul unui agitator mecanic cu 100 rotatii/minut prezenta anticorpilor se traduce prin aparitia de aglutinate (flocoane) mai mult sau mai putin voluminoase exprimate astfel:

0 = rezultat negativ, fara aglutinate (flocoane).

+ = rezultat incert, nesigur

+ + = rezultat slab pozitiv (aparitia de flocoane vizibile la aglutinoscop, lichid tulbure).

sau + + + + = rezultat pozitiv (aparitia de flococoane voluminoase, vizibile, iar lichidul devine limpede).

Citirea se face cu ajutorul unei lupe puternice sau cu ochiul liber (ura 5).

Reactii calitative fals pozitive se intalnesc in sarcina, dar si in stari patologice, ca: disproteinemii, ciroza, hepatita virala, lupus eritematos diseminat, unele parazitoze, lepra, toxicodependenta etc.

ura 5 : Reactia VDRL carbon (stanga - reactie pozitiva; dreapta - reactie negativa)

(https://www.lycos.fr/vdrl-carbon.htm)

Reactia cantitativa

In tuburi de hemoliza se realizeaza dilutii de ser de bolnav, in progresie geometrica in baza 2 (nediluat, diluat 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32), fiecare tratat cu antigen cardiolipinic.

Titrul este dat de ultima dilutie prezentand o reactie slab pozitiva ++. Testul cantitativ constituie o buna metoda de depistare si urmarire a evolutiei bolii si a tratamentului, precum si eventualele recontaminari.

3.1.2. Testul RPR carbon (rapid plasma reding test)

Este o reactie de aglutinare care utilizeaza particule de carbon invelite cu antigen cardiolipinic.

Sunt teste rapide, de aglutinare pe lama. Reactia pozitiva se traduce prin aparitia de grunji de culoare gri si limpezirea suspensiei(ura 6).

ura 6: RPR carbon test.

(https://www.tdh.sate.tx.us./lab.serology_agg.htm)

3.1.3. Reactia de fixare a complementului (Bordet-Wassermann)

Da mai putine rezultate biologice fals pozitive, dar poate da rezultate negative la bolnavii cu sifilis tertiar. Desi se mai foloseste in practica medicala, nu mai ureaza in Nomenclatorul International al actelor biologice din octombrie 1980.

Cinetica anticorpilor anticardiolipinici: acestia apar intre a 8-a si a 20-a zi de la debutul sancrului. Nivelul lor creste rapid in timpul sifilisului secundar. Se negativeaza printre ultimele reactii serologice in sifilis. In lipsa unui tratament, nivelul lor se mentine in platou, la valori variabile de la un individ la altul. In anumite forme viscerale de sifilis, se pot negativa in mod exceptional.

3.2. Reactii cu antigene treponemice (TPHA, FTA-ABS, NELSON, ELISA

Sunt realizate cu germeni vii sau omorati, sau cu fractiuni antigenice specifice Tr. pallidum.

3.2.1. TPHA (Treponema Pallidum Haemagglutination Assay)

Este o reactie de hemaglutinare pasiva a hematiilor, sensibilizate cu un antigen extras din Tr. pallidum, la contactul cu serul uman de cercetat.

Reactia se efectueaza in microplaci cu fund rotund; in paralel cu proba de testat se face si un test martor cu hematii nesensibilizate (ura 7).

Reactia calitativa este un test de depistare. Se foloseste ser de bolnav diluat 1/80.

Reactia cantitativa permite stabilirea titrului de anticorpi la un bolnav depistat pozitiv prin reactia precedenta. Se realizeaza dilutii din serul de testat, in progresie geometrica in baza 2 (1/80; 1/160; 1/320). Titrul anticorpilor este dat de ultima dilutie care da o reactie pozitiva.

Cinetica anticorpilor: testul TPHA se pozitiveaza catre a 3-a sau a 4-a saptamana de la debutul infectiei (aproximativ o saptamana de la aparitia sancrului. In timpul negativarii testelor serologice, TPHA este cel care persista cel mai mult.

ura 7: Testul TPHA

( https://www.bmb.eeds.ac.uk/tpha.htlm)

3.2.2. Reactia de imunofluorescenta FTA 200 (Fluorescent Treponemal Antibody Test)

Este o reactie de imunofluorescenta indirecta care se realizeaza punand in contact treponeme omorate integral cu serul de bolnav diluat 1/200. Dupa spalare, anticorpii fixati pe treponeme erau evidentiati cu ser fluorescent antiglobuline umane totale.

Deoarece testul a dat destul de multe reactii fals pozitive, el a fost inlocuit cu testul FTA-Abs (Fluorescent Treponemal Antibody-Absorbtion test).

3.2.3. FTA-Abs (FTA-Absorbit)

Deriva din precedentul: serul de bolnav este in prealabil absorbit cu treponeme saprofite nepatogene (tulpina Reiter) in scopul de a suprima antigenele dirijate catre antigenele de grup ale treponemelor. Etapele ulterioare sunt similare testului FTA 200.

Rezultatele calitative se exprima in trepte de pozitivitate (+ = limita pozitivitatii; + + pana la + + + + test pozitiv).

Rezultatele cantitative se realizeaza din testarea dilutiilor geometrice in baza 2 a serului de bolnav (1/50; 1/100; 1/200; 1/400). Titrul este dat de ultima dilutie care prezinta o fluorescenta ++ (slab pozitiva).

Testul este sensibil si specific, pozitiv in toate stadiile bolii, confirmand un diagnostic de sifilis si permitind, totodata, urmarirea eficacitatii tratamentului.

Reactii fals positive apar in boli auto-imune, boala de Lyma, herpesul genital.

Testul necesita personal calificat, experimentat si aparatura si reactivi de calitate.

Cinetica anticorpilor fluorescenti arata ca sunt decelabili inca de la aparitia sancrului. Exista in toate etapele bolii, disparitia lor spontana fiind cu totul exceptionala. Se negativeaza lent.

3.2.4. Determinarea IgM specifice anti-treponemice (FTA-Abs IgM)

Imunoglobulinele IgM apar inca din a doua saptamana de la contactul infectant. Ele sunt evidentiate printr-o reactie de imunofluorescenta indirecta avand drept revelator un conjugat fluorescent monospecific anti-lanturi m (anti IgM).

La bolnavii netratati ele se regasesc inca din faza secundara; la pacientii tratati corespunzator, imunoglobulinele scad rapid si dispar in general din prima luna care urmeaza tratamentului.

Testul are ca indicatie majora sifilisul congenital, dar este util si in depistarea infectiei recente, a reinfectiilor si in sifilisul neurologic.

Din pacate poate da atat reactii fals pozitive, determinate de prezenta factorului reumatoid, a anticorpilor nucleari, cat si reactii fals negative legate de competitia cu IgG pentru receptori.

3.2.5. Testul de imobilizare a treponemelor (TIT sau TPI) sau testul Nelson

Tehnica de referinta, dar care nu mai este utilizata decat in laboratoare de cercetare specializate, deoarece implica intretinerea de animale vii infectate si preturi de cost ridicate.

Principiu: tulpini de Tr. pallidum vii, virulente, deci mobile, sunt imobilizate ca urmare a actiunii anticorpilor bolnavului (numiti imobilizine) si a complementului cobaiului.

Tehnica: dupa 18 ore de incubare la 35^oC in atmosfera de azot imbogatita cu 5% CO₂ treponemele din tubul de testat (T) se numara si se a cu cele dintr-un tub martor (M) fara complement.

Procentul de imobilizare, in care se exprima rezultatele calitative, este dat de raportul: M T/ M astfel :

0 20% = test negativ;

21 50% = test suspect;

51 100% = test pozitiv.

Testul este considerat toxic, adica neinterpretabil, atunci cand in tubul martor treponemele sunt moarte. Cauzele acestei toxicitati nu sunt cunoscute.

Recoltarea probei de la bolnav se face a jeun si dupa intreruperea oricarui tratament cu antibiotice.

Cinetica anticorpilor. ,,Imobilizinele sunt decelabile intre a 25-a si a 40-a zi de la aparitia sancrului, adica la finele fazei primare si debutul fazei secundare. In lipsa tratamentului, acesti anticorpi persista in toate stadiile, disparitia lor spontana fiind cu totul exceptionala. Tratamentul precoce determina negativarea testului Nelson; in schimb, testul ramane pozitiv cu atat mai frecvent cu cat tratamentul a fost instituit mai tardiv.

3.3 Alte teste

3.3.1 Tehnicile imuno-enzimatice de tip ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) cu diferite tipuri de antigene purificate de T. pallidum, pentru IgG si IgM.

3.3.2 Testul de inunoaderenta-disparitie (TPIA)

3.3.3 Testul de imunodisparitie intraperitoneala (TPID)

Alegerea reactiilor serologice

Multitudinea de reactii de diagnostic serologic al sifilisului se explica prin faptul ca nici una nu este perfecta pentru a confirma sau infirma cu certitudine infectia sifilitica pe toata durata bolii.

Ca o regula generala, nu este recomandabil niciodata sa se foloseasca o singura reactie serologica atunci cand se urmareste depistarea si diagnosticarea acesti boli. In campaniile de depistare se vor executa pentru fiecare ser doua reactii dintre care obligatoriu una cu antigen treponemic. Pentru confirmarea diagnosticului si urmarirea eficientei tratamentului se va folosi un set de teste de rutina cu antigene cardiolipinice si treponemice. Este indicata si efectuarea reactiilor serologice cantitative care ofera indicatii privind scaderea titrului anticorpilor in cursul tratamentului specific.